1．   標(biāo)本制備：

2．   zui小化非特異性結(jié)合：

 

1．凋亡的檢測方法：和其它

2．PI染色法

3．Annexin V 法

4．TUNNEL法

 

1．激活的細(xì)胞因子

2．CBA

 

1．活化

2．活化檢測

3．網(wǎng)織血小板

 

1．網(wǎng)織紅細(xì)胞

2．PNH

3．胎兒紅細(xì)胞

 

1．DNA 細(xì)胞周期

2．蛋白

3．多藥耐藥

4．微小殘留白血病

 

 

 

 

 

 

 

  （一）直接免疫熒光標(biāo)記法

  取一定量細(xì)胞（約1X10⁶細(xì)胞／ml），在每一管中分別加入50μl的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上（）,再直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)（如做雙標(biāo)或多標(biāo)染色，可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時加入），。孵育20-60分鐘后，用PBS（pH7．2—7．4）洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機(jī)檢測。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標(biāo)抗體試劑成本較高，但減少了間接標(biāo)記法中較強(qiáng)的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測。

  （二）間接免疫熒光標(biāo)記法

  取一定量的細(xì)胞懸液（約1X10⁶細(xì)胞／ml），先加入特異的*抗體，待反應(yīng)*后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物，以FCM檢測其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費(fèi)用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研標(biāo)本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強(qiáng)，易影響實驗結(jié)果。所以標(biāo)本制備時應(yīng)加入陰性或陽性對照。另外，由于間標(biāo)法步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失，不適用測定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。

 

1．熒光標(biāo)記的抗體的濃度應(yīng)該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增加。

2．在使用*抗體之前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清來作為標(biāo)記的第二抗體。這個步驟通過阻斷*抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來降低背景。

3．在使用*抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標(biāo)記的第二抗體一起培育。這個步驟會減少不必要的第二抗體與*抗體、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。

通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標(biāo)記過的抗體可以略過此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時候它也會導(dǎo)致已標(biāo)記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復(fù)合體的形成。這種復(fù)合體會優(yōu)先與一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合，或者它們zui終會導(dǎo)致期望得到的抗體活性的丟失。

4．使用F（ab’）2片段會使背景決定于*或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F（ab’）2片段容易利用。而*抗體的F（ab’）2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN₃存在的條件下，將新鮮組織或細(xì)胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入*抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。

5．其它：已標(biāo)記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)也可能會有背景影響。為了降低背景，在多重標(biāo)記過程中，所有的已標(biāo)記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應(yīng)。

 

 

 

隨著研究的進(jìn)展，僅僅對細(xì)胞進(jìn)行定量和活性的檢測已不能滿足需要。在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的表達(dá)能力對研究細(xì)胞因子在疾病中的作用越來越顯的重要無比。目前檢測單個細(xì)胞特定細(xì)胞因子的表達(dá)手段包括：ELIspot、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)、限制性稀釋分析（limiting dilution analysis，LDA）和單細(xì)胞PCR，應(yīng)用原位雜交技術(shù)和免疫組化方法觀察細(xì)胞因子蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)可以識別Th1和Th2細(xì)胞，此方法可獲得較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)信號，但此方法工作量大、主觀性強(qiáng)，難以進(jìn)行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細(xì)胞PCR技術(shù)，技術(shù)性強(qiáng)、勞動強(qiáng)度大，難以進(jìn)行廣泛推廣。隨著多標(biāo)記及胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，使對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的研究推向了一個新的階段。下面主要對胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞技術(shù)作以介紹。
　　早期細(xì)胞因子表達(dá)與細(xì)胞功能相關(guān)性研究是基于特定克隆細(xì)胞的激活。盡管研究應(yīng)用T淋巴細(xì)胞克隆證明了不同細(xì)胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－?）與TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但這些研究很難外推，因為T細(xì)胞克隆與體內(nèi)T細(xì)胞功能相關(guān)性還未被揭示。

近來，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預(yù)孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法使得細(xì)胞因子聚集，蓄積，增強(qiáng)細(xì)胞因子信號可被流式細(xì)胞儀檢測。因為自然狀態(tài)下，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子，通常要對T淋巴細(xì)胞體外活化進(jìn)行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細(xì)胞因子信號較弱，難以進(jìn)行檢測。這一方法可檢測單個細(xì)胞內(nèi)多個細(xì)胞因子，并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。在細(xì)胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細(xì)胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細(xì)胞因子增強(qiáng)時可被逆轉(zhuǎn)。且這些研究清楚地證明，只有激活的細(xì)胞亞群可以表達(dá)細(xì)胞因子，靜止的正常淋巴細(xì)胞（T、B、NK）不能分泌細(xì)胞因子。

胞內(nèi)流式分析法是用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌，同時采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的zui小熒光背景。具有其它方法*的優(yōu)點：

Ø         快速：流式定量檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子可在一天內(nèi)完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時，快速簡便；

Ø         簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；

Ø         靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測系統(tǒng)；

Ø         ：可以在同一個細(xì)胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的亞型，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析；

Ø         安全：減少樣本處理與生物源性污染

Ø         接近生物體的分析條件：全血檢測保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況。

 

1.         流式上樣管及細(xì)胞培養(yǎng)皿或板

2.         25%CO₂，37℃孵箱

3.         混勻振蕩器

4.         離心機(jī)

5.         加樣器、Tips

6.         流式細(xì)胞儀

 

全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。

自身血漿中外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內(nèi)分析。

組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）：用Ficoll分離PBMCs，將細(xì)胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×10⁶細(xì)胞/ml。

細(xì)胞系與T細(xì)胞克隆：調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度2×10⁶細(xì)胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。

冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細(xì)胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細(xì)胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細(xì)胞進(jìn)行破膜和染色。

 

1、細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑

依據(jù)實驗需要選擇特殊表面標(biāo)志

CD45圈定所有淋巴細(xì)胞
CD3 圈定T淋巴細(xì)胞
CD4 圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群

CD8 圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群
CD19/或CD20圈定B淋巴細(xì)胞
CD56圈定NK淋巴細(xì)胞
CD14圈定單核細(xì)胞

2、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體：R&D提供FITC、PE和APC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體

3、溶血素：用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333）溶解紅細(xì)胞

4、激活劑

①      Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目錄號ALX-445-004-M001）

A. DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL

B. 分裝（20?L），－20℃儲存。勿反復(fù)凍融

C.每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液

D.PMA終濃度25ng/mL細(xì)胞懸液

②      Ionomycin  （Alexis,目錄號ALX-450-006-M001）

A.       于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL

B.       －20℃儲存

C.      每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液

D.      Ionomycin終濃度1?g/mL細(xì)胞懸液

③      Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma,Catalog No.S-4881）

A.     無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL

B.     4℃儲存

C.    SEB終濃度10?g/mL細(xì)胞懸液

④      CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞

⑤      CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml

5、阻斷劑

阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)

① Brefeldin-A（BFA） （eBioscience，目錄號00-4506）

A. 于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL
B. 分裝（20?L），-20℃儲存。勿反復(fù)凍融。
C. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
D. 激活zui后4－5小時BFA終濃度10?g/mL細(xì)胞懸液。

注意：BFA過度孵育會導(dǎo)致細(xì)胞活力下降

② Monensin （eBioscience，目錄號00-4505）

6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、 固定劑：細(xì)胞在體外刺激后需要對細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號00-8222）

8、 破膜劑：含1％皂甙、0.05％*的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號00-8333）

將細(xì)胞膜穿孔，已利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，于相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合

9、其它試劑：無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。

 

細(xì)胞活化的zui終結(jié)果是產(chǎn)生細(xì)胞因子，根據(jù)檢測指標(biāo)和標(biāo)本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺激時間，以獲得*的實驗結(jié)果。下表提供了檢測一些常用細(xì)胞因子的推薦的活化方法。

表1、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法

為防止細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的zui后4-6個小時，需要使用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑 （如3uM monensin，10mg/ml的BFA）

方法1:  只使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測

方法2: 人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM） 刺激4-24 小時.

方法3: 人的PBMC 使用LPS （0.5 - 1 ug/ml） 刺激24 小時.

方法4: 人的PBMCs或者純化的CD4^＋細(xì)胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10 ng/ml，目錄號202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目錄號204-IL-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細(xì)胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；zui后收獲細(xì)胞，使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM）刺激6小時

方法5: CD4⁺ T 細(xì)胞使用PHA （10 ng/ml） 刺激4 days

方法6: T 細(xì)胞使用抗CD3 的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b （Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1）

方法7: 使用PMA （50 ng/ml） 和Ionomycin （500 ng/ml）刺激

方法8: PBMCs細(xì)胞使用重組人IFN? （10 ng/ml，目錄號285-IF-100） 刺激2 小時，然后使用IFN? （10 ng/ml） + LPS （1 ug/ml） 刺激22小時或者使用相同的方法刺激THP-1 細(xì)胞.

方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗體（25 ug/ml） 的培養(yǎng)板中，使用抗CD28 抗體（2 ug/ml） + PMA （5 ng/ml） + Ionomycin （500 ng/ml） 刺激6小時

方法10: CD4^＋T細(xì)胞在包被小鼠CD3（25 ug/ ml）抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug/ml）的抗體，重組小鼠的IL-2（10 ng/ml，目錄號402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目錄號404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；zui后收獲細(xì)胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小時。

方法11: 小鼠ip巨噬細(xì)胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時

方法12: 小鼠脾細(xì)胞使用PMA （5 ng/ml）和Ionomycin （500 ng/ml）刺激6小時

 

1、   收獲細(xì)胞：肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時加蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（參照說明書）， 混勻后，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)4-6小時

①      加適當(dāng)?shù)募?xì)胞表面染色試劑20?L于Falcon管中，加入100?L激活后的全血 （細(xì)胞濃度維持在2×10⁶/mL） 混勻，室溫暗處孵育15分鐘；

②      加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。（注意：PMA激活的全血可能會溶血不*。）

③      離心500g 5分鐘，棄上清

①      加固定劑，室溫暗處孵育15分鐘，離心500g 5分鐘，棄上清；

②      加破膜劑溫暗處孵育10分鐘。（劑量參照說明書）

③      加2?3mLPBS洗液，離心500g 5分鐘，棄上清。

5、細(xì)胞內(nèi)染色

①      加入熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。

②      加2?3mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清，加入500?LPBS上機(jī)或加入500?L 1% PFA固定后再上機(jī)

 

1.         標(biāo)本處理：避免使用絡(luò)合鈣的抗凝劑，如ACD與EDTA，因為它們會限制鈣依賴性激活過程，推薦用肝素鈉。此外LPS，一種常見的生物試劑污染物，是強(qiáng)細(xì)胞激活劑，可能會混淆試驗結(jié)果。血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。

2.         刺激激活：檢測不同的細(xì)胞因子根據(jù)情況選擇不同的刺激劑組合和刺激時間，以保證*的檢測效果。比如，要檢測IFN-γ則可選擇PMA和Ionomycin同時刺激；如果用CD4做表面標(biāo)記，由于多數(shù)病人的CD4抗原會因PMA的激活而有不同程度的下調(diào)，所以培養(yǎng)時間不能太長，4-6小時為宜，否則CD4下調(diào)影響分析

3.         選擇合適的對照：為保證結(jié)合的真是和可靠性，至少熒光設(shè)置以下對照：

①        未刺激對照：激活時由于BFA的存在抑制了胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此在激活過程中產(chǎn)生  的抗原與細(xì)胞因子會滯留胞內(nèi)，未刺激對照也應(yīng)包含BFA。

②        激活對照：激活對照使用細(xì)胞表面表達(dá)CD69來評價激活與否，如果未達(dá)到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當(dāng)或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。

③        同型對照：使用與熒光標(biāo)記抗體相同來源、相同標(biāo)記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色。

4.         Fc受體阻斷：使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目錄號14-0161-81），在大鼠可以用純化的抗大鼠的CD32，在人可以用過量的同種無關(guān)純化Ig或血清。

5.         熒光素的選擇：檢測相對低表達(dá)細(xì)胞因子如IL-4時，應(yīng)選用PE或APC標(biāo)記；單檢測某一細(xì)胞因子時也選用PE或APC標(biāo)記；同時檢測多種細(xì)胞因子時，弱表達(dá)的應(yīng)選用PE或APC，F(xiàn)ITC標(biāo)記用于高表達(dá)細(xì)胞因子如IFN-γ

 

 

 

 

盡管目前提出了較多的 Th1/Th2細(xì)胞表面標(biāo)志，但根據(jù)淋巴細(xì)胞因子譜的異同識別Th1和Th2細(xì)胞仍然是目前zui有效的手段，特別是細(xì)胞內(nèi)因子標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)。近來由于細(xì)胞因子ELISA試劑盒的不斷涌現(xiàn)，為研究Th1/Th2細(xì)胞因子譜的變化提供了準(zhǔn)確、可靠、快速的測定方法。但研究CD4+淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子譜變化時需要將T淋巴細(xì)胞特異克隆。zui近發(fā)現(xiàn)，在外周血白細(xì)胞中，除CD4淋巴細(xì)胞外，CD8細(xì)胞也存在Th1和Th2樣細(xì)胞因子譜的變化，甚至酸性粒細(xì)胞也具有產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的能力，如酸性粒細(xì)胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此單純通過細(xì)胞因子譜的變化難以有效識別Th1和Th2細(xì)胞。

根據(jù)T輔助淋巴細(xì)胞（CD4）分泌的細(xì)胞因子譜（cytokine profiles）的不同,將CD4細(xì)胞分為Th1和Th2亞群。Th1細(xì)胞主要分泌γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）和腫瘤壞死因子-β（TNF-β）,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。在多數(shù)免疫反應(yīng)中，T輔助淋巴細(xì)胞并不產(chǎn)生典型的Th1或Th2細(xì)胞和相應(yīng)的細(xì)胞因子，而主要是由Th0細(xì)胞分泌的混合型的細(xì)胞因子。但在疾病的狀態(tài)下，Th0細(xì)胞受特異抗原的刺激時，一方面向Th1方向發(fā)展，另一方面可能向Th2方向發(fā)展。如在結(jié)核感染轉(zhuǎn)狀態(tài)下可產(chǎn)生Th1和Th2雙向免疫反應(yīng)，在I型超敏反應(yīng)疾病時主要產(chǎn)生以Th2為主的免疫反應(yīng)。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2平衡失調(diào)參與多種疾病過程，如腫瘤免疫、移植免疫及變態(tài)反應(yīng)等，而用流式細(xì)胞儀進(jìn)行Th1/Th2的檢測克服了傳統(tǒng)方法所得結(jié)果為整個群體分泌數(shù)值不能區(qū)分單個細(xì)胞或亞群的反應(yīng)的不足，通過表面染色多參數(shù)分析可以區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。一般用CD3⁺/CD4⁺  或CD3⁺/CD8^-作表面標(biāo)記，選擇相應(yīng)的熒光標(biāo)的抗體，Th1和Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況如下：

 

全血標(biāo)本經(jīng)過刺激培養(yǎng)、表面標(biāo)記、固定、破膜、胞內(nèi)染色（IQ，Cytodetect™kit（basic），CAT方法，IQP-367）后結(jié)果如下：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小時后，按照操作程序測得參考值如下：

 

 

 

 

血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板減少癥等疾病的病理生理過程與血小板相關(guān)。血小板功能檢測包括黏附、聚集和活化功能試驗。使用流式細(xì)胞儀檢測全血中血小板表面相關(guān)標(biāo)志物是一種新技術(shù)，它拓寬了血小板相關(guān)疾病的診斷與功能研究方法，豐富了血小板功能評估指標(biāo)。

 

一、流式細(xì)胞儀血小板分析應(yīng)用范圍

1.　通過分析信號傳遞、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、顆粒釋放、糖蛋白構(gòu)形、膜磷脂、與抗凝因子的結(jié)合和微粒形成，分析血小板活化，血小板對刺激物的反應(yīng)性。

2.       通過分析受激后表面結(jié)合蛋白觸發(fā)凝血鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和表面糖蛋白缺陷檢測，分析血小板止血功能的獲得性和遺傳性缺陷。

3.       結(jié)合血小板大小，檢測血小板RNA含量，分析血小板成熟度，計數(shù)網(wǎng)織血小板。

4.       發(fā)現(xiàn)血小板抗體，做定性和定量分析。

 

1.           血栓性疾病：活化血小板的檢測能預(yù)測冠狀血管成形術(shù)后發(fā)生急性缺血事件的危險性，非風(fēng)濕性心房纖顫患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰島素依賴性糖尿病，子癇前期，外周血管疾病等均可測出血小板活力增加和（或）循環(huán)中存在活化血小板，而早產(chǎn)兒的血小板對凝血酶、二磷酸腺苷（ADP）、TXA2的體外激活能力降低。

2.           血小板缺陷性疾病：全血法流式細(xì)胞術(shù)提供了一個簡單、迅速的方法來診斷血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板綜合征，血小板無力癥等。前者是由于GPIb-IX復(fù)合物先天缺陷所致的血小板形態(tài)巨大，功能異常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物先天缺陷，導(dǎo)致血小板聚集功能障礙

3.       貯存池疾病：原發(fā)性貯存池疾病（δ-SPD）常規(guī)用血小板聚集法檢測，但特異性和靈敏度均不理想。檢測血小板致密顆粒的阿的平熒光顯微鏡法，主觀性大，操作繁瑣，而且一次檢測的血小板數(shù)目有限。全血法流式細(xì)胞術(shù)為δ-SPD的診斷提供了一個簡單、迅速的方法，一次能定量檢測5 000個以上阿的平染色的血小板。與正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色顯著下降（從49%降至15%）。常在骨髓增殖異常綜合征和晚期腎衰中出現(xiàn)的獲得性致密顆粒貯存池疾病，也能用全血法流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測和診斷。

4.           血小板減少性疾病：破壞過多或生成減少均能導(dǎo)致血小板減少。血小板相關(guān)抗體（PAIg）是反映血小板的破壞的指標(biāo)，雖然其臨床意義仍有爭議。PAIg的檢測有多種方法，但流式細(xì)胞術(shù)法有其*性。流式細(xì)胞儀能測定單個血小板上的PAIg，只要測定104甚至103個血小板，在統(tǒng)計學(xué)上就能地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制備的血小板就足夠。流式細(xì)胞術(shù)還能同時測定其他一些反映血小板破壞的指標(biāo)，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成與巨核細(xì)胞有關(guān)，全血法流式細(xì)胞術(shù)能像檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞那樣，檢測分泌到循環(huán)中的“網(wǎng)織”血小板，來判斷血小板的生成。“

5.           血小板儲存與輸注：用P-選擇素（CD62）、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)血庫中儲存血小板有時間依賴性的活化現(xiàn)象。儲存5天以上，40%～60%血小板表達(dá)活化標(biāo)志CD62。雖然其形態(tài)改變、乳酸脫氫酶泄漏以及β-TG的釋放也能反映其活化，但用CD62作為儲存血小板的質(zhì)量控制指標(biāo)。活化的血小板在循環(huán)中的存活時間很短。若血小板在儲存時活化了，即使輸注也不能很好地提高患者止血能力。

6.           抗血栓藥物的監(jiān)測：活化血小板的檢測可以判斷患者是否需要抗血栓藥物治療，也可以監(jiān)測這些抗血栓藥物的作用，避免毒副反應(yīng)的發(fā)生。

7.           此外，全血法流式細(xì)胞術(shù)還可用于檢測血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，測定嚴(yán)重血小板減少患者的血小板數(shù)目。

 

1.　全血中血小板更接近生理狀態(tài)。

2.       操作簡便，減少由于操作造成的血小板狀態(tài)改變（如血小板活化試驗）。

3.       同時檢測血小板的多個標(biāo)志物，結(jié)合FSC和SSC，評估多個參數(shù)，進(jìn)行定量分析。

4.       多采用血小板特異抗體CD41或CD61畫門，找出血小板，避免雜質(zhì)碎片的干擾。

5.       檢測血小板亞群靈敏度高。

6.       用血量少。

7.       無放射性污染。

 

1．抽取抗凝全血：檢測血小板功能時，應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化的抽血規(guī)程。做血小板活化試驗時，應(yīng)盡量減少人為造成的血小板活化。

2．Falcon管中加取全血和適量直標(biāo)熒光抗體，充分混勻，室溫避光處反應(yīng)，通常放置15分鐘。

3．1%多聚甲醛固定樣本。

4．上機(jī)檢測

 

1.　陰性對照（Isotype Control）：非特異熒光的強(qiáng)弱取決于抗體濃度、單克隆熒光抗體特異性和純度，應(yīng)與試驗管抗體相對應(yīng)。在多色分析時，同型對照應(yīng)與其它抗體同時使用，以避免補(bǔ)償造成的誤差。

2.            血小板體外活化試驗：使用正常人活化標(biāo)本作為陽性質(zhì)控。使用正常人未活化標(biāo)本作為陰性質(zhì)控。

3.            血小板自身抗體檢測：使用含有已知血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陽性質(zhì)控。使用不含血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陰性質(zhì)控。

4.            血小板表面抗原缺失：如巨血小板癥血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板無力癥血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或異常。使用正常人標(biāo)本做陽性對照，抗體的同型對照做陰性對照。

 

1.　FSC-SSC點圖中找出血小板，缺點是血小板較小，不易通過大小將碎片或雜質(zhì)*分開

 

2.       從CD41或CD61-SSC點圖中畫出血小板門，由于特異性高，可以有效地去除碎片和雜質(zhì)的干擾。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

流式細(xì)胞儀分析血小板的活化

 

血小板活化試驗，對于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意義。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行多參數(shù)分析，可以特異靈敏地檢測血小板表面標(biāo)記，了解血小板的活化狀態(tài)和反應(yīng)性，并同時獲得更多關(guān)于血小板的信息。在疾病監(jiān)測、抗血小板治療病人的篩選及治療監(jiān)測、預(yù)測并發(fā)癥等方面有良好的應(yīng)用前景。

 

1.檢測血小板的反應(yīng)性。

2.了解血小板活化進(jìn)程。血小板先發(fā)生膜糖蛋白變化，然后是胞漿內(nèi)顆釋放到血小板外。

3.     同時檢測多種血小板表面標(biāo)志。

4.     高度靈敏。

5.     直接檢測血小板的多種標(biāo)志。

6.     使用全血，標(biāo)本量少。

7.     操作簡便快捷，將血小板人工激活減至zui低。

 

1.       血小板特異性膜糖蛋白：血小板膜糖蛋白已被深入研究，下表顯示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在這些膜糖蛋白中，僅在血小板膜表面表達(dá)主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的幾種，根據(jù)這些特異性糖蛋白制備的熒光單抗，能在全血中特異性地識別血小板。

表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

 

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纖維蛋白原；Fn纖維粘連蛋白；

Vn體外粘連蛋；LRG富含亮氨酸家族

 

 

2.       活化血小板的標(biāo)志物：活化血小板與靜息血小板相比，其質(zhì)膜糖蛋白常發(fā)生顯著的變化，這些變化的糖蛋白便成為活化血小板的檢測標(biāo)志物,這些標(biāo)志物可分為三類：*類是血小板顆粒膜上的糖蛋白。血小板被激活時，其顆粒膜與質(zhì)膜發(fā)生融合，顆粒膜蛋白，如CD62、CD63，在質(zhì)膜上表達(dá)，成為活化血小板的分子標(biāo)志。第二類是血小板質(zhì)膜表面變化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）的PAC1表位，它僅在血小板活化時才因構(gòu)象變化而顯露出來。因此，使用這個表位的熒光單抗，我們能更地在更早階段檢測到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）雖然在靜息血小板上也表達(dá)，但活化血小板上表達(dá)量更高；GPIb-IX-V復(fù)合物（CD42）則相反，與靜息血小板相比，活化血小板上表達(dá)量顯著降低。第三類是出現(xiàn)在活化血小板上能與血小板表面受體相結(jié)合的一些抗原，包括纖維蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。這些抗原在血小板表面的出現(xiàn)和消失在臨床檢測上也是有意義的。

3.       除檢測免疫性的分子標(biāo)志物外，流式細(xì)胞術(shù)還能檢測一些反映活化血小板功能的非免疫性指標(biāo)。如用Ca2+濃度敏感的熒光染料檢測胞內(nèi)Ca2+流，用能進(jìn)入血小板致密顆粒的熒光染料阿的平來檢測活化血小板的釋放功能等。

4.       單抗的選擇：與血小板有關(guān)的CD單抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61（特異的泛血小板表面標(biāo)記，既與活化血小板結(jié)合，也與未活化血小板結(jié)合。CD61與CD41聯(lián)合，即為血小板表面gpⅡb/Ⅲa復(fù)合物），CD62，CD63 ，CD107a-b等，。活化血小板的檢測需選擇針對活化血小板標(biāo)志物的CD單抗。表2列舉了活化血小板檢測的一些代表性單抗。

表2　活化血小板CD單抗簡介

 

 

 

三、操作步驟

1.      標(biāo)本采集：

（1）     枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管順序編號。

（2）     抽取靜脈血，采血管中注入2ml。

（3）     于10分鐘之內(nèi)完成血小板激活和染色步驟，操作時應(yīng)注意減少人工激活。

2.      血小板激活：

（1）     試管內(nèi)加入50mlADP（也可選用其他激活劑，如PMA、纖維蛋白、TRAP），450ml全血，輕輕搖勻。

（2）     室溫孵育5分鐘。

（3）     立即染色。

3.      熒光抗體染色：

（1）     Falcon管編號。

（2）     在對照管中加入同型對照、CD61、PAC－1和RGDS（PAC－1的阻斷劑）。

（3）     在試驗管中加入CD62P、CD61和PAC－1。

（4）     在對照管和試驗管中各加入未激活或激活的血標(biāo)本5ml。

（5）     輕輕混勻，室溫暗處孵育15-20分鐘。

（6）     各管中加入1ml冷的固定液 （2-8°C），充分混勻， 2-8°C陰暗處放置30分鐘。

（7）     24小時內(nèi)上機(jī)分析。

4.      結(jié)果分析：

在CD61 vs SSC點圖中設(shè)門找血小板群。 CD61 vs SSC 點圖顯示有三群，

CD61陽性/低SSC一群主要由單個血小板組成，CD61陽性/高SSC一群主要由黏附血小板的血細(xì)胞組成， CD61陽性/散射光更低的一群主要由血小板來源的

碎片組成。由于在生理和病理情況下，血小板群和紅細(xì)胞群的大小、顆粒度會有交叉，因此，不建議使用FSC-SSC圖設(shè)門。    在CD61 vs SSC點圖中找出CD61 陽性的血小板群 （單個血小板和黏附在WBC上的血小板），設(shè)門。

 

 

1.       采血時請用大號針管，抽出的前2ml血應(yīng)棄去不用。

2.       盡量避免標(biāo)本受到物理振動。

3.       取血后10分鐘內(nèi)完成染色操作。

4.       在Falcon管中加血標(biāo)本5ml，管壁上不能有殘留血，未染色的部分會影響試驗結(jié)果。

5.       為了檢測和控制血小板體外激活，建議使用正常未受激活的血標(biāo)本平行做質(zhì)量控制。