免疫組化技術常見問題

1、一抗的選擇要點和技巧是什么？

（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

（2）應用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。

（3）種屬反應性的選擇（species reactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。

（4）種屬來源，一般兔來源的多是多克隆；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據此來源來選擇相應的二抗。

（5）生產廠家的選擇。不同廠家的同一種抗體它的實際效價穩定是不同的。

2、石蠟切片和冰凍切片的比較？

（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結論。因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。

（2）冰凍切片的優點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時不需抗原修復這一步。缺點是細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。

（3）石蠟切片的優點可以保持組織細胞的形態結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態都較冰凍切片好。

3、在什么情況下使用Triton-X100

（1）Triton X-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學（>10um厚切片） 和免疫細胞化學中一般用Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。

（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。

（3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。

4、封閉血清的選擇原則是什么？

（1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續結果的假陽性！

（2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合，否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合，會造成背景。

（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。

5、抗體孵育條件的比較？

（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度overnight和從冰箱拿出后37度復溫45min。

（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。

6、一抗4度孵育后為什么要進行37度復溫？

（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；

（2）另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度Overnight拿出后，直接用PBS洗沒發生過脫片現象。事實勝于雄辯！

7、DAB顯色時間如何把握？

（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗；

（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；

（3）此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；

（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（一抗4度Overnight）；另一方面就是封閉時間過長。

8、免疫組化結果如何分析？

（1）陽性著色細胞計數法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。

（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用image j進行灰密度分析，然后進行統計分析即可。

（3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為 0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），zui終可以分數相加，再進行比較。

對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。

9、在什么情況下進行組織抗原修復，抗原修復的條件是什么？

（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。

（2）修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH的等）。

（3）微波修復，我們一般用6min*4次，效果不錯。

10、內源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？

（1）一般3%過氧化氫滅活時間短點，可以10min左右；而0。3%過氧化氫則可以適當延長封閉時間，一般10~30min。

（2）用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片。

（3）現用現配，配好后4度避光保存。

11、如何才能充分脫蠟？

（1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時隱時現、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須*脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短；

（2）脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長。

（3）當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫 10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。

總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要*、干凈、*地脫去切片上的蠟。

12、如何zui大限度地降低組織非特異性染色？

（1）縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是zui重要的一條。

（2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

（3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

（4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

（5）縮短DAB孵育時間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等；

（6）適當增加PBS沖洗次數和浸洗時間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

（7）防止標本染色過程中出現干片，這容易增強非特異性著色。

13、蘇木素復染時間的把握？

（1）蘇木素復染時間要看當時的室溫、溶液的新舊、目標抗原的定位等情況，一般數秒-數分鐘。不過這個如果染色不理想可以補救的。即：染色深則分化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。

（2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。

（3）如果分化的顏色過淺，可以復置于蘇木素中染色。

14、PBS的清洗方式選擇、次數和時間的選擇？

（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。

臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響zui后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。

（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。

沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。

（3）沖洗的時間要足夠，才能*洗去結合的物質。

沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能*沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續2分鐘左右就*足夠了。

（4）PBS的PH和離子強度的使用和要求。

中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。

（5）常用試劑的配制和使用。

在免疫組織化學的染色過程中，用得zui多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。

15、脫片產生的原因和如何防止脫片？

（1）多聚賴氨酸玻片質量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。

（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。

（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。

（5）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。

（6）修復的問題：抗原修復的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

（7）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

16、背景染色較深的原因有哪些？

（1）抗體濃度過高：一抗濃度過高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡單的按說明書進行染色。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鐘，因此，要根據染色結果進行調整。

（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB現用現配，如有沉渣應進行過濾后再用。配制好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時立即終止反應。不過當染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現實，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控，避免顯色時間過長。

（4）組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

（5）切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在4？C冰箱Overnight，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。

（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

17、蘇木素復染后氨水返藍這一步如何做、濃度多少、時間多長？

答：返藍可以用堿性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45度溫水、冷水藍化均可。一般藍化5~10 min。淡氨水有人用50ml自來水+三四滴的氫氧化銨。