免疫組化技術(shù)規(guī)范

歐美國家相繼開展了免疫組化質(zhì)量控制工作，建立了一套比較完善的質(zhì)量控制方法和程序。中國病理工作者委員會（CCP）免疫組化研究中心借鑒國外的先進經(jīng)驗并結(jié)合我國當(dāng)前的實際情況開始探索一種適合我國免疫組化質(zhì)控的方法，同時，發(fā)現(xiàn)和推廣標準化的染色程序，改善和提高免疫組化實驗的可靠性，使免疫組化技術(shù)更具標準化，免疫組化結(jié)果更具可靠性和重復(fù)性。盡管免疫組化在許多實驗室中已常規(guī)開展，但它是一個多步驟、多因素決定的一種實驗方法，由于各實驗室采用的修復(fù)方法、染色方法、試劑廠家、抗體克隆號、檢測系統(tǒng)等有所不同，染色結(jié)果會出現(xiàn)較大差異，相當(dāng)部分的實驗室對免疫組化標準化的認識尚欠足夠重視, 致使不良的染色結(jié)果對病理診斷引起誤導(dǎo)，因此免疫組化染色結(jié)果的可靠性受到了極大的關(guān)注。

在實際工作當(dāng)中有許多因素影響著免疫組化的結(jié)果，包括技術(shù)人員是否熟練掌握整個實驗的操作程序、抗體的特異性、方法的敏感性、標本的固定、組織的處理、是否進行抗原修復(fù)、修復(fù)液的PH值等等因素。為了讓每個實驗室能夠持續(xù)穩(wěn)定地完成可靠的實驗染色結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將免疫組化染色技術(shù)中的全部流程納入標準化。

一、 免疫組化成功的要素

病理科醫(yī)生要有相當(dāng)?shù)拿庖呓M化診斷知識和免疫組化技術(shù)經(jīng)驗，要清楚認識免疫組化技術(shù)是一門實驗性、技術(shù)性非常強的技術(shù)，要多了解多種抗體在組織中的表達情況，以及影響免疫組化結(jié)果的各種因素，只有提高醫(yī)生的免疫組化診斷水平才能避免錯誤的判斷，才能確保免疫組化診斷的準確性。病理技術(shù)人員是免疫組化實驗成功的關(guān)鍵因素，操作人員要有豐富的免疫組化的理論知識及熟練的免疫組化染色技術(shù)，十分清楚每一個步驟的應(yīng)用原理，使實驗結(jié)果更具可靠性。可靠的實驗試劑和實驗方法是每個實驗室的*條件。由于實驗方法多種多樣，抗體的品種繁多，每個實驗室都應(yīng)當(dāng)確保高質(zhì)量價的試劑，并摸索出*的實驗條件。的免疫組化取決于有效的抗原修復(fù)、敏感的檢測系統(tǒng)、合適的實驗質(zhì)控對照及熟練和有責(zé)任心的技術(shù)人員。

二、免疫組化染色前處理技術(shù)操作規(guī)范

1．取材：理想的取材厚度是0.2cm～0.3cm，大多數(shù)實驗室都認為組織在加熱抗原修復(fù)過程中造成脫片的主要原因是取材過厚或脫水浸蠟處理不當(dāng)所致。良好的取材、固定、脫水過程是免疫組化質(zhì)控的前提，如果H&E切片都做不出滿意的染色結(jié)果，那么免疫組化染色也將無從談起，根本無法保證染色質(zhì)量。

2．固定：在眾多的組織固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等），不同的實驗方法在使用上各有千秋。但在保持組織細胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測定性、組織滲透性以及試劑的價格上，福爾馬林是、既經(jīng)濟又通用。而含酸或含汞的固定液對抗原保存均不理想。組織離體后固定一般不要超過30分鐘，在常溫條件下固定時間為8-24小時。同時還要注意避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原丟失，有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過福爾馬林一周固定后組織抗原丟失嚴重，抗原幾乎不能被檢測，因為組織固定后會引起蛋白或蛋白分子之間形成交聯(lián)，導(dǎo)致抗原位點遮蓋，可以通過抗原修復(fù)方法來修正，若加抗體前不采用抗原修復(fù)，則免疫組化染色常不能到達理想結(jié)果或不成功。組織同樣不能長時間放置在70%的乙醇中，酒精固定后的組織形態(tài)不如福爾馬林固定的組織。脫鈣液對抗原破壞較為嚴重，因此在組織脫鈣前在福爾馬林液中固定48小時，若組織沒有固定透則酸會破壞抗原，脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時間都必須盡量控制在zui低的限度。

3．浸蠟：我們認為浸蠟溫度應(yīng)控制在58～60℃左右，浸蠟用的石蠟應(yīng)經(jīng)常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細胞收縮，更容易掉片。

4．切片厚度：用于免疫組織化學(xué)染色的切片厚度為3-4微米。為防止在染色過程中脫片，需要使用硅化玻片裱片。

5．硅化玻片的制備：載玻片經(jīng)酸洗沖洗干凈后烤干； 2%APES丙酮或*中浸泡1～2min；丙酮或*洗1～2分鐘；蒸餾水浸洗1～2min；烤干備用。

6．烤片：切片在60℃～65℃烤箱中烤片30－60分鐘左右。有些實驗室采用烤片O。有報導(dǎo)烤片溫度超過60℃時，烤片時間超過18小時的切片，免疫組化染色強度比烤4小時的切片要略弱。溫度過高或時間過長均會影響抗原的活性，原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。

7．切片保存：一些實驗室研究人員習(xí)慣將組織蠟塊連續(xù)切片后長期保存在室溫條件下，切片后的組織在室溫下長期保存抗原可以損失。實驗室在實驗中發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后，在室溫下保存三個月以上，免疫組化染色結(jié)果會出現(xiàn)減弱或陰性情況。并進行了新、舊切片的保存時間對照實驗，選擇11種不同組織蠟塊每例連續(xù)切片10片，共110片，常溫空氣中放置一個月、三個月、半年、一年與新切片進行成對對照實驗。實驗結(jié)果表明：組織蠟塊切片后在室溫下保存三個月，抗原對多數(shù)抗體的敏感性約下降一半，部分切片丟失更多。切片保存半年多數(shù)的抗體不能出現(xiàn)陽性標記結(jié)果，保存一年以上僅有個別的切片能夠有微弱的陽性表達，尤其核表達的抗原丟失更為突出。國外也有類似的資料報道。其原因可能與空氣中的氧化作用有關(guān)，所以在實際工作可以采用蠟封切片來避免抗原損失以便長期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中實驗的切片更應(yīng)注意切片的保存。

8．脫蠟：免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同，免疫組化實驗室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟*，否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。

三、免疫組化實驗中的抗原修復(fù)

1．酶消化：如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶

2．抗原熱修復(fù)：高壓法、微波法、水煮法

*，免疫組化染色中zui關(guān)鍵的莫過于抗原修復(fù)，而絕大多數(shù)常用抗體的修復(fù)是通過加熱來完成的，熱抗原修復(fù)優(yōu)于酶消化，更有效，染色結(jié)果更易一致，操作單一。

3．修復(fù)時間：既要獲得zui強的染色結(jié)果，又要保持組織形態(tài)的完整性。許多抗原修復(fù)存在的問題是組織固定時間過短時，強烈的抗原修復(fù)可引起形態(tài)破壞、脫片及組織*消化，解決的方法可采用較短時間的熱修復(fù)或減少酶的消化時間。

4．抗原修復(fù)緩沖液：有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）、 Tris (pH7-8)、EDTA(pH8.0～9.0) 、 EGTA(pH9.0) 等，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的優(yōu)點是染色背景清晰，適合于大多數(shù)抗體，Tris和 EDTA兩種修復(fù)液對部分抗原修復(fù)效果較強，但其染色背景同時加深，如使用不當(dāng)易造成假陽性結(jié)果的判斷。目前還沒有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體，檸檬酸緩沖液（pH6.0）可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液，但也不能除外某些抗體適用于EDTA和EGTA緩沖修復(fù)液，一般抗原比較難于表達的抗體多選擇高pH值的修復(fù)液。例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。

5．抗原熱修復(fù)注意事項：無論哪一步都不要讓切片干凅，加熱后需要冷卻15－30分鐘。充分的抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的*重要因素，加熱的溫度和時間可導(dǎo)致修復(fù)不足或過度修復(fù)。

6．抗原熱修復(fù)對組織中內(nèi)源性生物素的影響：抗原熱修復(fù)在增強抗原決定簇表達的同時，也增強了組織中內(nèi)源性生物素的反應(yīng)。采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）檢測系統(tǒng)，組織中內(nèi)源性生物素容易出現(xiàn)人為假象，在加熱抗原處理條件*相同的陰性對照片中可以觀察到較強的內(nèi)源性生物素的反應(yīng)，沒有經(jīng)過熱抗原處理的切片中沒有出現(xiàn)類似的情況。在細胞漿中呈均一的細顆粒狀的淺棕色陽性，有時表達也非常強，與真陽性的結(jié)果表達很相似，在以往的免疫組化染色中內(nèi)源性生物素的影響對診斷造成許多的誤差，卻常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚，陰性對照片必須與一抗的抗原修復(fù)處理條件*相同，才能準確發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性生物素出現(xiàn)的部位。

7．內(nèi)源性生物素封閉方法：一般在抗原修復(fù)以后，加抗體前使用卵白素進行生物素阻斷處理，也可使用非生物素的檢測系統(tǒng)，如：EliVision、EnVision、SuperVesion等。

四、免疫組化染色實驗操作規(guī)范

1.脫蠟：二甲苯 ――→ 酒精 ――→ 蒸餾水

2．內(nèi)源性過氧化物酶的消除：采用過氧化物酶的檢測系統(tǒng)，必須進行內(nèi)源性過氧化物酶封閉處理。如果不進行處理，組織中的紅細胞、粒細胞會干擾染色結(jié)果的判斷。常用0.3%H2O2作用切片10分鐘，對染色結(jié)果及抗原保存都沒有影響，封閉效果比較顯著。

3．血清封閉：在加入一抗前需用二抗的正常血清進行封閉，可以減少非特異性結(jié)合。目前使用的二步法檢測系統(tǒng)可以免去這一步驟。

4．抗體使用：已有大量的即用型抗體供實驗室使用，廠家已進行過多次的實驗檢測，可按廠家提供的條件進行操作。濃縮型抗體一般按照廠家提供的建議稀釋度，進行對倍稀釋預(yù)實驗。選定*的稀釋滴度后再進行批量實驗。染色背景深大多是抗體濃度過高所致?？贵w孵育溫度一般以常溫25℃為基準或37℃30分鐘，也可4℃冰箱overnight。

5．沖洗：常用的沖洗液為PBS或TBS緩沖液，要嚴格執(zhí)行沖洗步驟，防止因沖洗不凈引起的背景著色，緩沖液中加入Tween20可以增強沖洗效果。

6．檢測系統(tǒng)：通用的檢測系統(tǒng)有生物素標記的ABC、SP、LSAB等，此類檢測系統(tǒng)較為經(jīng)濟，日前仍有不少醫(yī)院在使用。非生物素類檢測系統(tǒng)價錢較貴，由于不需通過生物素的結(jié)合，可以避免內(nèi)源性生物素的干擾，其特點：敏感、省時、方便、背景低。7．顯色系統(tǒng)：由于檢測系統(tǒng)采用的是辣根過氧化物酶，因此選擇DAB（棕色）和AEC（紅色）作為酶的底物，若采用堿性磷酸酶系統(tǒng)則選擇BCIP/NBT（藍紫色）,常規(guī)免疫組化顯色的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT陽性雖鮮艷，但陽性定位不準確。

8．復(fù)染：襯染步驟十分簡單，但襯染的好壞對染色zui終結(jié)果的質(zhì)量影響很大。有的選用Harris蘇木素，有的用Mayer’s蘇木素，且與DAB染色對照效果，在絕大多數(shù)實驗室中使用簡單方便。也有實驗室使用甲基綠襯染襯染，但不能經(jīng)有機溶劑，容易退色。

五、染色結(jié)果的觀察

1．陽性結(jié)果應(yīng)定位在細胞相應(yīng)的部位，在細胞膜表達的抗原陽性結(jié)果應(yīng)定位在細胞膜上，在其他部位
的陽性反應(yīng)均為非特異性染色。不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會導(dǎo)致抗原在組織細胞中定位的改變。根據(jù)所檢測抗原的不
同，抗原分別定位在：

（1）細胞膜：如LCA和CD3、CD20等；

（2）細胞質(zhì)：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；

（3）細胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。

2．組織的周邊、氣泡、刀痕、皺折等部位往往呈現(xiàn)非特異性陽性表達。

3．染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)。

4．組織切片背景深與下列因素有關(guān)：

（1）石蠟切片脫蠟不干凈；

（2）*抗體濃度過高或孵育時間過長，溫度過高；

（3）顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多；

（4）抗體不純；

（5）抗體孵育后切片清洗不干凈。

六、免疫組化實驗對照

為證實抗體和檢測試劑盒效價是否可靠，染色操作是否正確，一般需要進行實驗對照，以避免試劑失效或操作失當(dāng)而出現(xiàn)假陰性和假陽性，確保染色結(jié)果的可靠性。

1．陽性對照:選用已知染色中度陽性以上的組織切片染色，陽性切片應(yīng)呈陽性，此外組織中的內(nèi)對照也是很好的陽性對照。

2．陰性對照:選用已知染色陰性的組織切片染色，其結(jié)果應(yīng)為陰性。每次實驗中增加Vimentin染色作為對照，目的是觀察組織經(jīng)福爾馬林固定后預(yù)期抗原表達的敏感性，按福爾馬林固定后抗原損傷的程度來進行分析。Vimentin幾乎在任何組織中都有表達，尤其適合活檢組織中的免疫組化染色觀察。在與上皮組織相連接的間質(zhì)中存在著大量的血管Vimentin可陽性表達，如果在同一張切片的間質(zhì)中出現(xiàn)Vimentin染色微弱或部分區(qū)域變?nèi)醯那闆r，表明是不當(dāng)?shù)墓潭▽?dǎo)致抗原破壞。所以在每批次實驗中應(yīng)常規(guī)加入Vimentin染色，用于指導(dǎo)觀察福爾馬林固定后抗原表達敏感性情況。

七、抗體的保存和稀釋

一般來說，抗體應(yīng)放在4℃冰箱中保存，*抗體可分成小包裝于-20℃保存，使用時存放在4℃，不宜反復(fù)存放于4℃和-20℃之間，反復(fù)凍融會使抗體效價下跌。檢測系統(tǒng)一般不宜于-20℃保存，因為反復(fù)凍融使得與抗體結(jié)合的酶容易分解，導(dǎo)致檢測的敏感度降低。濃縮的抗體在染色前應(yīng)根據(jù)說明書要求或自行摸索出的*工作濃度進行稀釋。可將抗體稀釋至1：10，染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時間較長，反之稀釋后的抗體保存的期限較短，如使用即用型抗體，經(jīng)過一定時間后應(yīng)注意其效價時否有所降低，避免出現(xiàn)假陰性染色。

Nestin、PDGFR 可用于胃腸間質(zhì)瘤的診斷指標，尤其對CD117陰性胃腸間質(zhì)瘤在診斷上有很大的幫助，在國外已有文獻報導(dǎo)。這兩種抗體可用于常規(guī)固定的石蠟切片，經(jīng)實驗證明Nestin 用PH8.0 EDTA高壓修復(fù)，PDGFR用PH6.0 檸檬酸微波修復(fù)效果較好。