ELISA操作常見問題和解決方法

更新時(shí)間：2015-09-23

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ELISA操作常見問題和解決方法

ELISA即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，是目前廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體檢測的方法，主要有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。ELISA操作步驟看似簡單，整個(gè)測定過程中卻有諸多影響因素，導(dǎo)致檢測結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果偏差較大。為幫助大家分析實(shí)驗(yàn)中常見問題，我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結(jié)于下表：

問題一：高背景或陰性對照值偏高

可能原因	建議
陰性對照孔被陽性對照或樣品污染	洗滌時(shí)，勿將洗液溢出孔外。
洗滌不充分	確保在洗滌時(shí)每個(gè)孔都充滿了液體，確保將殘余液體從孔中移除。
酶結(jié)合物過濃	請檢查酶結(jié)合物是否按說明書規(guī)定稀釋
孵育溫度過高	檢查孵育箱的溫度是否正確、穩(wěn)定
底物在使用前曝光	應(yīng)保存在暗處，避光。
讀板前停留時(shí)間過長	加終止液后3分鐘內(nèi)讀數(shù)

問題二：陽性對照值偏低或低吸光度

可能原因	建議
蒸發(fā)	各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板。
溫度不均勻	校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板。

問題三：邊緣效應(yīng)

可能原因	建議
蒸發(fā)	各步之間，須使用封版膠密封反應(yīng)板
溫度不均勻	校準(zhǔn)孵育箱，勿疊放反應(yīng)板

問題四：標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳

可能原因	建議
倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)未混勻	稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的每一步均需混勻
過早稀釋	標(biāo)準(zhǔn)品在快要使用時(shí)稀釋
加入的體積不正確	使用校準(zhǔn)過的移液器，快速、等量的將標(biāo)準(zhǔn)品分配到各個(gè)微孔中

問題五：標(biāo)準(zhǔn)曲標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣本無檢測信號(hào)

可能原因	建議
樣本中無檢測物或檢測物含量極低	設(shè)置內(nèi)參，重新實(shí)驗(yàn)
樣本中其他物質(zhì)影響/掩蓋檢測	作適當(dāng)稀釋，降低其他物質(zhì)的干擾，或作系列稀釋，檢測回收率。
樣本中檢測物濃度過高，Hook效應(yīng)導(dǎo)致假低值	適當(dāng)倍數(shù)稀釋樣本，檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內(nèi)。

問題六：重復(fù)性較差

可能原因	建議
微孔中有氣泡	用針尖挑破氣泡
試劑未混勻	確保充分混勻試劑
樣本中有雜質(zhì)或沉淀物	使用前離心
微孔包被面被吸頭劃破	加液時(shí)小心操作
使用用過的封板膠紙	每次須使用新的封板膠封住反應(yīng)孔